Aller au contenu Aller au menu Aller à la recherche

accès rapides, services personnalisés
Rechercher
Labex MATISSE
MATériaux, InterfaceS, Surfaces, Environnement

Caractérisation sur biopsies de calcifications associées aux pathologies rénales

Fichet technique

  • Intitulé : Caractérisation sur biopsies de calcifications associées aux pathologies rénales
  • Thème : Axe 1 : Biominéralisation : identification des mécanismes moléculaires sous-jacents
  • Financement :
    - MATISSE : 50%
    - MiChem : 50%
  • Responsable scientifique du projet : Ivan Lucas
    Maître de conférences, équipe « techniques et modélisation » du LISE
  • Co-porteurs :
    - Dominique Bazin - LCMCP
    - Michel Daudon, Vincent Frochot - Hôpital Tenon
  • Localisation : LISE, Université Pierre et Marie Curie (UPMC).
    L’équipement complète et optimise la plateforme « nanoRaman / TERS » du LISE à l’UPMC, inaugurée en octobre 2015, incluant un microspectromètre Raman haute résolution (Labram HR800 évolution, Horiba, Japon), équipé de 3 lignes laser 473, 532, 633 nm et couplé à deux microscopes en champ proche (AFM, STM : AIST, Etats-Unis).

Présentation du projet scientifique

Nous proposons dans ce projet de démontrer le potentiel de la spectroscopie Raman pour le diagnostic précoce de pathologies rénales. Dans cette optique, une mise à niveau de la plateforme NanoRaman au LISE est nécessaire.

Importance de l’étude des calcifications pathologiques

Le spectre des pathologies susceptibles d’induire des dépôts minéraux pathologiques, tels que les calculs rénaux (lithiases uriques, calciques ou cystiniques), est très étendu : cancer, infections, maladies environnementales et génétiques. La calcification rénale peut également rendre compte d’un désordre métabolique d’un autre organe, tel que le foie [1]. En l'absence de traitement, l’insuffisance rénale apparaît inexorablement et aboutit plus ou moins rapidement au décès du malade, le seul traitement efficace étant la double transplantation hépato-rénale. La détermination des caractéristiques physicochimiques de ces formes de dépôts minéraux anormaux, calciques ou non, dans un tissu ou un organe permet de poser un diagnostic médical précoce. Ce dernier est d’importance car, en plus du coût humain évident, le coût financier de cas non-diagnostiqués menant au stade final de l’insuffisance rénale (ESRF) est très lourd pour la société (par an: traitement par patient ~ 95 K€, 3100 transplantations : ~250M€).

Enfin, sur le plan physicochimique, le phénomène de minéralisation est un problème complexe lié à la synthèse de nanomatériaux hybrides minéral-organique dans un milieu à fluide circulant (inhomogène et pH variable entre 4.5 et 7.6) dont la géométrie est de type « microfluidique » avec des parois qui sont le siège de transfert d’anions et de cations. L’élucidation du problème nécessite donc le déploiement d’outils physicochimiques adaptés.

Nouvelle approche diagnostique

L’émergence dans le domaine médical de nouvelles technologies diagnostiques (microscopie et spectroscopie vibrationnelle : μFTIR & « SMIS » sur synchrotron [2]) a permis ces dernières années un nouveau paradigme concernant l’étude des calcifications pathologiques. Bazin et al au travers d’une collaboration entre le LCMCP et l’hôpital Tenon ont ainsi pu établir un lien entre la pathologie et les caractéristiques structurales de la calcification [1,2] : forme, taille, nature chimique des cristaux. Dans cette approche, la description à différentes échelles (du macroscopique à l’échelle atomique) des conditions pathogéniques qui sous-tendent la genèse de ces dépôts minéraux apparaît primordiale.

La spectroscopie Raman comme sonde des calcifications: La spectroscopie μRaman est une spectroscopie vibrationnelle utilisant une lumière d’excitation visible qui permet à la fois la cartographie de composition avec une résolution spatiale submicrométrique (~exc/2) et la mesure en solvant aqueux. De plus, de par des règles de sélection très restrictives, les transitions Raman sont moins nombreuses que les transitions IR et les signatures spectrales d’autant plus claires. Un travail récent [3] réalisé par les co-porteurs de ce projet et le PECSA visant à comprendre la formation de microcristaux d’oxalate de calcium en conditions microfuidiques a montré la possibilité de détecter et distinguer par microscopie Raman les différentes phases en présence comme présenté en figure 1.

Figure 1 : I) Synthèse microfluidique de microcristaux d’oxalate de calcium par co-précipitation et micrographie du dépôt obtenu révélant la zoologie des tailles et formes des cristaux formés, II) Cartographie d’intensité de bandes Raman propres aux cristaux d’oxalate de calcium mono et di-hydratés (A : cristaux jumelés et B : bipyramides respectivement).

Un projet ambitieux à deux niveaux 

Le problème majeur que nous avons rencontré lors de des mesures μRaman sur biopsies est la forte excitation de fluorescence qui tend à dominer le signal. L’utilisation d’une longueur d’onde d’excitation proche infrarouge, 785 nm, permettra de minimiser ce fond de fluorescence tout en gardant un niveau de signal Raman important (IRaman α 1/4) comme démontré en figure 2. La cartographie simultanée par microRaman à 785nm et par microscopie en champ proche (AFM) de biopsies rénales pourra ainsi être envisagée afin d’établir la relation structure composition des différentes phases cristallines en présence.

Figure 2 : Cartographies Raman : I) à 633 nm montrant un contraste dû aux seules variations de fluorescence, II) à 785 nm montrant la détection de calcification micrométrique (mesures réalisées au laboratoire d’application Horiba).

Dans cette première approche, la résolution spatiale en composition est limitée par diffraction (~400nm), et les objets de taille nanométriques peuvent rester indétectés. Afin d’effectuer un diagnostic plus précoce des pathologies, nous aurons recours à la spectroscopie Raman exaltée sous pointe (TERS) afin de caractériser les calcifications nanométriques. Nous nous appuierons ici sur un laser 633nm équipé d’une polarisation radiale. L’exaltation locale du champ électrique par la pointe AFM en or ou en argent permet une sensibilité et une résolution spatiale accrues ainsi que l’extinction de fluorescence.

Un projet aux savoir-faire complémentaires

Ce projet est fédérateur car organisé autour de trois institutions, le LISE et le LCMCP à l’UPMC et le CHU Tenon qui ont déjà collaboré fructueusement ces derniers mois, et directement applicatif puisqu’il s’attelle à la compréhension des pathologies rénales, à partir de biopsies réalisées dans un cadre médicale sur patients atteints de maladies comme le sida. Le projet, de par les compétences qu’il réunit (biologistes, physicochimistes), de par l’originalité de l’approche et des techniques mises en oeuvre et de par la très forte représentation des pathologies rénales dans la population et leur incidence sur la société promet de plus un fort impact en termes de publication.

Faisabilité & calendrier de réalisation

Les deux axes du projet, dépendants de l’installation des deux équipements demandés seront abordés en parallèle. 

  1. « Etablissement de la relation structure/composition des calcifications par μRaman sur biopsies». La faisabilité des mesures Raman à 785nm a été déjà démontrée lors de mesures effectuées au laboratoire d’application Horiba et présentées figure 2. Le couplage avec la microscopie AFM, STM est déjà maîtrisé par le LISE [4] et sera implémenté rapidement. Un travail important devra être réalisé afin d’optimiser la préparation des échantillons (épaisseur, planéité) en vue des cartographies AFM: Janvier-Décembre 2017. 
  2. « Détection et caractérisation de nanocalcifications par spectroscopie TERS ». Effectué en deux phases : a) développement du TERS en transmission sur échantillons modèles réalisé en collaboration avec Horiba qui souhaite commercialiser ce mode de mesure. Le LISE dispose en outre des savoir-faire nécessaires (dont la fabrication des sondes) pour la mise en oeuvre des mesures TERS (spectre et cartographie de composition), même en milieu liquide, comme démontré dans une publication récente [5] : Janvier-juillet 2017, b) mesures sur biopsies dont la préparation aura déjà été optimisée pour les mesures AFM : Juillet-décembre 2017.

Conditions d'utilisation des équipements (personnel et budget)

L’équipement sera inclus dans la plateforme NanoRaman TERS de l’UPMC, inaugurée en juillet 2015, et dont les différents modes sont accessibles sur demande auprès du LISE: microscopies à sondes balayantes (mesures AFM, STM, « tuning fork » / μRaman co-localisées), spectroscopie et cartographie micro et nanoRaman (en mode réflexion). Les mesures μRaman et TERS seront effectuées au LISE par Ivan LUCAS (MdC), Florence Billon (ingénieure), un stagiaire ingénieur rémunéré par Horiba (6 mois) et un stagiaire de licence (3 mois : LISE). Les coûts de fonctionnement sont liés à l’achat ou à la fabrication de sondes AFM-TERS uniquement. 

Le Labex Matisse en soutenant ce projet, se dote d’un instrument de mesures aux performances parfaitement adaptées à la caractérisation (topographie et composition) de nanomatériaux inorganiques, organiques (SAM) et biologiques, complémentaire des techniques sous ultra vide (XPS, microscopies électroniques et microscopies rayon X sur synchrotron), et permettant en plus l’implémentation en milieu liquide, voire en condition électrochimiques.

Cette technique pourra profiter aux chercheurs des 4 axes « Biominéralisation », « Matériaux multifonctionnels et environnement », « Interface, transport et réactivité » et « Dimensionnalité et confinement ». L’acquisition et l’utilisation de la ligne laser 785nm permettant de minimiser la fluorescence des échantillons sera par exemple très pertinente pour des applications comme celles liées au stockage de l’énergie. Dans le cadre d’une collaboration avec C. Laberty, l’analyse de membranes sulfoniques perfluorées ayant subi un traitement thermique a en effet montré un fond de fluorescence très important occultant totalement le signal Raman.

Le potentiel publicatif des techniques Raman/AFM co-localisées, donnant accès à la relation structure/composition est très grand, la nouveauté de la technique TERS, disponible dans peu de laboratoires, permet de plus d’envisager des publications dans des journaux à hauts facteurs d’impact.

Enfin, la collaboration entre le LISE et la société Horiba (siège : Palaiseau) pour le développement des mesures TERS en transmission (et en milieu liquide in fine), s’inscrit dans l’optique du Labex Matisse de nouer des liens étroits avec le monde industriel.

18/01/19

Traductions :

    MATISSE en chiffres

    • 4 disciplines : Chimie, Physique, Sciences de la Terre, Patrimoine
    • 400 permanents

    Contact

    Direction

    Florence Babonneau

     

    Administration

    matisse @ upmc.fr

     

    Communication

    Emmanuel Sautjeau

    emmanuel.sautjeau @ sorbonne-universite.fr