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Cryo-plongeur pour la cryo-microscopie électronique

Fiche technique

  • Intitulé : Cryo-plongeur pour la cryo-microscopie électronique
  • Financement :
    • MATISSE : 46%
    • IMPMC et ANR JCJC « PROMAFAO » : 17%
    • DIALOG CNRS : 37%
  • Responsable scientifique du projet :  Amélie Juhin
    Laboratoire / Equipe : IMPMC - MIMABADI
  • Co-porteurs : 
    • Equipe : BIOMIN (IMPMC)
      François Guyot 
    • Equipe : CIN (PHENIX)
      Vincent Dupuis
    • Equipe : BES (ISTeP)
      Fabrice Minoletti
    • Equipe : SMILES (LCMCP)
      Thierry Azaïs
  • Localisation : IMPMC
    Campus Pierre et Marie Curie - Sorbonne Université

Présentation du projet Scientifique

La cryo-microscopie électronique en transmission (cryo-MET) combinée à l’analyse d’images a permis d’opérer une révolution dans le domaine de la biologie structurale, qui a été couronnée par le prix Nobel de chimie en 2017. Les nombreuses découvertes réalisées grâce à cette technique pour imager des structures de protéines et des virus l’ont récemment popularisée bien au-delà de la biologie : les sciences des matériaux au sens large, incluant la chimie, la physique, la physico-chimie et les sciences de la Terre, se sont récemment intéressées à cette approche pour étudier des matériaux aussi variés que des catalyseurs, des colloïdes, des polymères, des biominéraux ou encore des assemblages microorganismesminéraux. Chacun de ces matériaux pose des questions spécifiques auxquelles la cryomicroscopie apporte des réponses, mais ils ont en commun une même contrainte : ces objets ne peuvent pas être observés en microscopie électronique classique car leur structure ou leur organisation est modifiée à cause du séchage du solvant ou des dégâts dus au faisceau d’électrons. Pour y remédier, il faut utiliser la cryo-microscopie, pour laquelle il est nécessaire de préparer les échantillons par refroidissement ultra-rapide (vitrification) à partir des conditions ambiantes. Les techniques de préparation des échantillons sont donc primordiales pour l’obtention de résultats à la fois reproductibles et novateurs.

Dans ce contexte, et au vu des nombreuses équipes de MATISSE désireuses d’utiliser la cryo-microscopie sur des objets divers, il est indispensable de s’équiper d’un cryo-plongeur à environnement contrôlé. Une goutte d’échantillon est déposée sur une grille qui est ensuite plongée dans l’éthane ou l’azote liquide, de façon automatisée. Cet instrument est commercial (FEI et Leica commercialisent les modèles les plus courants) et il est directement opérationnel pour réaliser la plupart des préparations. Il présente deux avantages par rapport aux techniques de préparation manuelle :

  1. la reproductibilité de préparation des échantillons. Cet appareil permet de contrôler la vitesse de plonge, le temps d’égouttage, mais aussi le taux d’humidité et la température de l’enceinte où la goutte d’échantillon est déposée sur la grille. Ainsi, des conditions expérimentales impossibles à créer manuellement peuvent être réalisées et contrôlées grâce à cet équipement. Pour certains échantillons (par exemple avec un solvant s’évaporant rapidement comme l’heptane, comme c’est le cas pour certains ferrofluides), la technique manuelle est même impossible à mettre en oeuvre.
  2. la facilité de préparation des grilles. La technique classique de préparation des grilles manuellement est délicate et un temps d’adaptation est nécessaire avant de pouvoir préparer des grilles exploitables (parfois plusieurs semaines si l’échantillon est difficile à préparer). Grâce au cryo-plongeur automatisé, les utilisateurs, et en particulier les étudiants, pourront préparer des grilles exploitables très rapidement : ils deviendront ainsi autonomes plus facilement ce qui représente un gain de temps et un gain financier considérable.

Plusieurs équipes de l’IMPMC, de PHENIX, du LCMCP et de l’ISTeP utilisent déjà la technique de la cryo-microscopie électronique, que ce soit pour l’observation d’échantillons fins comme des nanoparticules isolées, des ferrofluides présentant des assemblages de nanoparticules (MIMABADI, PHENIX [1]), d’échantillons plus épais comme des cellules entières -telles que des bactéries ou des algues phytoplanctoniques-, des tissus osseux, en méthode tomographique MET ou non, ainsi qu’en cryo-MEB (BIOMIN [2,3], ISTeP [4], LCMCP [5]) (voir Figure 1). La plupart des chercheurs ne maîtrisant pas la technique manuelle sont actuellement contraints de réaliser leurs préparations et leurs analyses à l’extérieur de l’UPMC dans des laboratoires équipés de cryo-plongeur, impliquant par conséquent des contraintes et des dépenses supplémentaires.

Figure 1 : (a) Auto-assemblage d’un ferrofluide de nanoparticules de CoFe2O4 observé en phase gélée par cryo- MET. (b) Premiers stades d’encroûtement d’une cellule d’E. coli par de l’hydroxyapatite en cryo-MET sur préparation vitrifiée. (c) Observation en cryo-MEB après vitrification d’un eucaryote unicellulaire biominéralisant des carbonates. (d) Coccosphère collapsée du coccolithophoridé Scyphosphaera apsteinii imagée en MEB classique : la technique de préparation avec cryo-plongeur permettrait d’obtenir des cellules intactes.

Ce projet d’achat de cryo-plongeur vise donc à remédier à cette situation, tout en offrant aux utilisateurs des différentes plateformes de microscopie une technique supplémentaire de préparation d’échantillons à forte valeur scientifique ajoutée, ce qui permettra d’élargir l’utilisation de la cryo-microscopie au-delà la communauté des biologistes. Le montant facturé à l’utilisateur, de l’ordre de quelques euros par cryo-plonge, sera calculé à partir du coût de revient (grille, filtres pour l’égouttage, fluides cryogéniques, maintenance). Sa mise en oeuvre bénéficiera de l’expertise d’un ingénieur d’études UPMC (J.-M. Guigner) maîtrisant la technique manuelle de préparation d’échantillons et les techniques de microscopie électronique, ce qui garantit une utilisation optimale de cet instrument.

Par ailleurs, un développement supplémentaire est envisagé pour le cas des échantillons de ferrofluides : conçu par la Cellule Projet de l’IMPMC, un environnement-échantillon basé sur un jeu d’aimants-permanents de SmCo montés sur un châssis amovible, placé dans le conteneur à azote liquide, permettra de geler ces ferrofluides en présence d’un champ magnétique permanent (Figure 2), dont on sait qu’il conduit à des structurations originales. Dans un deuxième temps, ce dispositif sera remplacé par une bobine réalisée sur mesure (GMW, 25 k€) permettant d’appliquer un champ magnétique variable. Cette réalisation sera partiellement financée par un projet ANR JCJC démarré en 2018, dont le but est d’étudier les propriétés de structuration de ces ferrofluides en relation avec leurs propriétés magnétiques.

Figure 2 : (a) Cryo-plongeur commercial, (b) égouttage, (c) conteneur à azote liquide, dans lequel viendra s’insérer le systèmes d’aimants permanents monté sur châssis (d) (©Cellule Projet IMPMC). Références (en gras : les chercheurs de MATISSE associés à ce projet): [1] N. Daffé, V. Dupuis (…) A. Juhin (2017). Nanoscale Distribution of Magnetic Anisotropies in Bimagnetic Soft Core–Hard Shell MnFe2O4@CoFe2O4 Nanoparticles. Advanced Materials Interfaces 22, 1700599. [2] J. Cosmidis, K. Benzerara, F. Guyot, …, J.–M. Guigner, F. Babonneau, C. Coehlo (2015). Calcium-phosphate biomineralization induced by alkaline phosphatase activity in Escherichia coli. Frontiers in Earth Science, 3, #00084, DOI=10.3389/feart.2015.00084 [3] J. Miot, K. Maclellan, K. Benzerara, N. Boisset (2011). Preservation of protein globules and peptidoglycan in the mineralized cell wall of nitrate-reducing iron(II) oxidizing bacteria: a cryo-electron microscopy study. Geobiology, 9, 459-470. [4] M. Hermoso, B. Lefeuvre, F. Minoletti, M. de Rafélis (2017). Extreme strontium concentrations reveal specific biomineralization pathways in certain coccolithophores with implications for the Sr/Ca paleoproductivity proxy. PloS ONE, 12, e0185655. [5] Y. Wang, (…) S . Cassaignon, F. Babonneau, T. Azaïs, N. Nassif (2013). Watermediated structuring of bone apatite. Nature Materials 12, 1144-1153.

18/01/19

Traductions :

    MATISSE en chiffres

    • 4 disciplines : Chimie, Physique, Sciences de la Terre, Patrimoine
    • 400 permanents

    Contact

    Direction

    Florence Babonneau

     

    Administration

    matisse @ upmc.fr

     

    Communication

    Emmanuel Sautjeau

    emmanuel.sautjeau @ sorbonne-universite.fr